华中农业大学研究生院(华中农业大学研究生院官网)

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华中农业大学食品科技学院柿多酚研究小组由李春美教授领衔，主要从事食品功能组分（膳食多酚）的挖掘和分子营养、果蔬、经济林果实及其副产物的精深加工及高值利用技术研究。以富含多酚的柿子、苹果、油橄榄、板栗、荔枝、茶等为对象，重点针对其加工与高值利用过程中关键性技术难点所涉及的化学结构、活性变化与机制及高值产品开发等方面展开了深入研究。特别是在柿功能性成分化学、活性及产品开发方面有长期工作积累，相关研究工作在Web of Science检索上位居世界第一，在本领域Top期刊《Crit. Rev. Food Sci. Nutr.》、《J. Agric. Food Chem.》、《Food Chem.》、《Food Hydrocolloids》、《Food Res. Intern.》及其它权威期刊上发表柿单宁相关研究论文53篇。此外，近几年承担了国家自然科学基金面上项目（4项）、国家重点研发计划（子课题）（2项）、教育部重点项目、湖北省重大科技攻关计划、公益性行业专项子课题等多项课题的研究。获得广东省科技进步一等奖2项（排名第3）、中华人民共和国农业部科技进步二等奖（排名第6）、中国产学研合作创新成果奖一等奖（排名第6）、中国轻工业联合会科学技术进步奖（排名第4）及神农中华农业科技奖（排名第6）各1项。

李春美教授研究小组在柿单宁（PT）领域取得的代表性研究成果如下：

一、柿单宁分级纯化及其结构解析

1、高纯度柿单宁分级制备

2007年12月8日，华中农业大学顾海峰和李春美*（通讯作者）在Food research international发表了题为Structural features and antioxidant activity of tannin from persimmon pulp的研究论文。

该研究小组建立了一套从柿果中获得高纯度柿单宁的提取工艺，简言之，首先采用酸化醇提法从柿果中获得了富含多酚的粗提物（16.9 mg/g），辅以超声等优化工艺并经过AB-8大孔树脂纯化，冷冻干燥获得了高纯度柿单宁（纯度为96.5%）。采用聚砜超滤膜（截留分子量10 kDa）将该粗提物分级成为低分子重量PT（Low molecular weight persimmon tannin: LMWPT）和高分子重量PT（High molecular weight persimmon tannin: HMWPT），经过HPLC–MS分析结果表明没食子酸是LMWPT级份中的主要组成，而HMWPT则在液相色谱图上显示一种宽包峰，见下图，其分子量分布在1.16×104 Da到1.54×104 Da，表明HMWPT结构非常复杂。随后采用多种抗氧化测试体系评估了LMWPT和HMWPT的抗氧化性能，结果显示HMWPT的抗氧化性能显著高于LMWPT，表明HMWPT是柿果中主要的抗氧化组成。

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2007.11.011

2、柿单宁结构解析取得重要进展

2010年7月27日，华中农业大学李春美（通讯作者）与美国迈阿密大学ANN E. HAGERMAN合作在Journal of agricultural and food chemistry发表了题为High Molecular Weight Persimmon (Diospyros kaki L.) Proanthocyanidin: A Highly Galloylated, A-Linked Tannin with an Unusual Flavonol Terminal Unit, Myricetin的研究论文。

该文章针对HMWPT复杂的结构特征，联用Thiolysis-HPLC-ESI-MS，MALDI-TOF MS，GPC，NMR技术对HMWPT的结构进行了系统性解析。结果表明HMWPT是一种大分子多聚物，其聚合度分布在19-47，延伸端由表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）组成，首次鉴定了其末端结构——EC和EGCG，以及非常罕见的杨梅酮末端，同时首次发现其C-C间除了B型连接外还包含大量A型连接。基于此，中国涩柿PT的结构式示意如下。该研究联用多项技术对PT的结构特征进行了系统解析，取得了突破性的结果，但由于现有技术的局限，对于PT结构的精细分析仍需继续。

https://doi.org/10.1021/jf102552b

二、柿单宁可作为绿色制备功能低聚体及新颖结构低聚体的优良原料

1、功能低聚原花青素的绿色制备

2020年12月16日，华中农业大学王瑞丰和李春美，李凯凯（通讯作者）在ACS food science & technology发表了题为Persimmon Oligomeric Proanthocyanidins Exert Antibacterial Activity through Damaging the Cell Membrane and Disrupting the Energy Metabolism of Staphylococcus aureus的研究论文。

由于PT高聚合度，肠道中吸收利用率低，限制了其在食品产业中的应用，因而该研究小组通过高压催化氢解法直接将PT进行降解，结果表明在120 °C, 3 h, 3 MPa和0.4 mg/mL of Pd/C最优条件下，柿低聚原花青素的最大降解产率达64.5%，其平均聚合度为2.8。采用UPLC-QTOF-ESI-MS对柿低聚原花青素进行组成分析，发现其主要包含3种单体，10种二聚体，和1种三聚体。这种高压催化氢解法具备耗时短，无需额外试剂即可将PT进行降解成为低聚体，但需要注意该法可能在反应过程中将A-型连接方式转化为B-型连接。此外，降解后获得的柿低聚原花青素的最低抑菌浓度为0.7 mg/mL，而PT的最低抑菌浓度为1.1 mg/mL，因此柿低聚原花青素具备比PT更强的抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。其抑菌机制是通过破坏细胞膜的渗透性和完整性，进而干扰能量代谢。

https://doi.org/10.1021/acsfoodscitech.0c00021

2、制备具有独特连接方式的新颖结构低聚体

2013年8月31日，华中农业大学董晓倩和李春美*（通讯作者）在Fitoterapia发表了题为Preparation of A-type proanthocyanidin dimers from peanut skins and persimmon pulp and comparison of the antioxidant activity of A-type and B-type dimers的研究论文。

建立快速的方法制备低聚体原花青素是研究其结构和构效关系的前提，由于PT结构的特殊性[含(E)C, (E)GC, (E)CG和(E)GCG四种组成单元，同时含A型和B型连接]，因此以PT作为底物，采用C和EGCG作为裂解剂，在酸性条件下，有望获得更多结构新颖的原花青素低聚体。该文章首先建立了一套从柿果中制备A-型连接原花青素二聚体的分离提取方法，首先采用酸化醇提法获得高纯度PT后，再采用酸解法将PT降解获得A型连接ECG二聚体（34.3 mg/1kg fresh persimmon fruit）和EGCG二聚体（37.7 mg/1kg fresh persimmon fruit）。随后优化了PT和裂解剂的反应条件，即在C与PT质量比为2:1，0.1mol/L盐酸-甲醇溶液40℃反应2h，便可获得4种新生成的原花青素二聚体，分别是B型连接的EC二聚体，B型连接的ECG-EC二聚体，B型连接的EGCG-EC二聚体，B型连接的(E)AFZ-EC二聚体，其中(E)AFZ-EC二聚体是第一次被报道。而在EGCG与PT质量比为8:5，0.1mol/L盐酸-甲醇溶液40℃反应2h，也可获得4种新生成的原花青素二聚体，A-型连接和B型连接二聚体各2种，分别是A型连接的EGCG二聚体，A型连接的EGCG-EGC-CH3二聚体，B型连接的EGCG二聚体，和B型连接的EGCG-EGC二聚体。因此，通过我们的方法可获得多种新颖结构的原花青素二聚体。随后通过体外及体内动物实验测试了二者的抗氧化性能，结果表明这两种二聚体以剂量依赖方式表现出强抗氧化性，尤其是在动物组织和脂质体系中，A型连接二聚体的抗氧化性能比B型连接的二聚体更为优越。

https://doi.org/10.1016/j.fitote.2013.08.019

相关文献：

徐泽.新型原花青素低聚体的制备及其生物活性研究.[硕士学位论文].华中农业大学，2015.

https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.12.023

三、柿单宁在降血脂、抗肥胖、解蛇毒等方面具有显著效果及其作用机制

1、柿单宁独特的连接方式及结构特征是其发挥降血脂、抗肥胖、降血糖、抗氧化、解蛇毒、抗菌等多重健康效应的关键

2023年5月30日，华中农业大学王瑞丰和李春美*（通讯作者）在International journal of biological macromolecules发表了题为Activity and potential mechanisms of action of persimmon tannins according to their structures: A review的综述论文。

该文章系统性回顾了PT的制备工艺、降解产物、生物活性及其潜在的作用机制。15年来，该课题组通过动物实验、细胞实验、微生物实验等考察了PT的健康效应，结果表明PT具备降血脂、抗肥胖、降血糖、抗氧化、解蛇毒、抗菌等多重健康效应，其他课题组还发现PT具有抗炎、抗辐射、抗病毒、抗衰老、抗癌、抗高血压等生物活性和强吸附重金属和染料性能。该文章还将PT的多项生物活性与其结构特征进行了关联，表明PT结构上的没食子酰基、A型连接方式、分子尺寸及聚合度是其发挥多种健康效应的关键结构特征。此外，由PT所施加的多重健康效应主要是通过灭活胞内脂质产生和炎症信号通路，激活脂肪酸氧化信号通路，调控肠道菌群，及高吸附效应而实现的。这种具备多重健康效应的功能膳食因子也有助于其在食品、营养和制药行业功能成分中的应用。

https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.125120

2、靶向细胞膜脂质筏为柿单宁及其特征结构单元发挥优异的降脂效果及作用机制提供了新视野

2014年5月19日，华中农业大学邹波和李春美*（通讯作者）在Food & Function发表了题为Persimmon Tannin accounts for hypolipidemic effects of persimmon through activating of AMPK and suppressing NF-kB activation and inflammatory responses in High-Fat Diet Rats的研究论文。

该研究比较了相同剂量的冻干柿果和柿单宁对高脂膳食饲喂小鼠的影响，结果发现冻干柿果和柿单宁相较于对照组均能显著降低血清甘油三酯和游离脂肪酸的含量，增加粪便中甘油三酯，胆固醇，胆汁酸的排泄，从而发挥优异的降血脂效果，这也表明柿单宁是柿果发挥降血脂生物活性的主要贡献者。进一步的机制研究表明柿单宁和柿果不仅能通过激活胞内AMPK信号通路下调脂质产生相关基因的表达（如sterol regulatory element binding protein 1(SREBP1), acetyl CoA carboxylase(ACC), fatty acid synthase (FAS)），进而预防肥胖的发生，而且还能通过抑制NF-kB炎症信号通路的激活改善喂食高脂肪饮食大鼠的肝脏脂肪变性情况。这些研究结果表明了柿单宁可作为一种优良的预防肥胖和改善脂肪肝的膳食功能因子。

https://doi.org/10.1039/C3FO60635J

2014年12月16日，华中农业大学邹波和李春美（通讯作者）在European journal of nutrition发表了题为Persimmon tannin represses 3T3‑L1 preadipocyte differentiation via up‑regulating expression of miR‑27 and down‑regulating expression of peroxisome proliferator‑activated receptor‑γ in the early phase of adipogenesis的研究论文。

脂肪细胞分化在肥胖的发生发展过程中至关重要，既然PT能发挥强烈的降脂效果，所以我们猜想PT能显著抑制脂肪细胞的分化，进而抑制脂滴的产生和积累。于是该研究便从抑制脂肪产生的过程考察了PT发挥强降脂活性的作用机制，研究结果表明PT能显著抑制胞内脂滴的积累，尤其是在早期分化过程中作用更为显著。这种显著的抑制脂肪细胞分化效应是因为PT处理后其关键的成脂转录因子PPARγ和CEBP/α被显著抑制，接着下游的脂质合成相关转录因子也被抑制。此外，miR-27a 和miR-27b作为调控PPARγ的关键基因在PT处理后也被显著上调，进而抑制了PPARγ的激活。

DOI:10.1007/s00394-014-0814-9

2015年10月30日，华中农业大学朱维和李春美*（通讯作者）在The Journal of Nutritional Biochemistry发表了题为A-type ECG and EGCG dimers disturb the structure of 3T3-L1 cell membrane and strongly inhibit its differentiation by targeting peroxisome proliferator-activated receptor γ with miR-27 involved mechanism的研究论文。

由于PT结构复杂，为进一步考察PT发挥强降脂活性的构效关系，我们将PT结构进行裂解获得了4种特征结构单元，分别是B型连接的EC二聚体，A型连接的EC二聚体，A型连接的ECG二聚体和A型连接的EGCG二聚体，以此来代表PT的结构特征并考察其构效关系和作用机制。结果表明A型连接的ECG二聚体和A型连接的EGCG二聚体是PT抑制脂肪细胞分化的特征结构单元，而且这两种二聚体同样能以类似PT的作用方式，通过上调miR-27基因的表达抑制PPARγ介导的胞内关键成脂转录因子的激活，进而抑制胞内脂滴的积累。鉴于细胞膜是保护细胞的第一道屏障同时也是胞内胞外信号传递的桥梁，因此，该文章考察了PT不同特征结构单元与细胞膜作用的差异，并将这种差异与其降脂效果进行关联。结果表明，没食子酰基和A-型连接方式是PT抑制脂肪产生的关键结构特征，同时细胞膜的流动性，水合性，渗透性都被强烈干扰，因此，这些结果表明PT导致的胞内成脂信号通路的抑制是源于其对细胞膜结构的干扰。

https://doi.org/10.1016/j.jnutbio.2015.05.006

2022年3月18日，华中农业大学王瑞丰和李春美（通讯作者）在Journal of agricultural and food chemistry发表了题为Targeting Lipid Rafts as a Rapid Screening Strategy for Potential Antiadipogenic Polyphenols along with the Structure−Activity Relationship and Mechanism Elucidation的研究论文。

前期本课题组从细胞膜与PT特征结构单元相互作用的视角发现不同结构多酚其破坏细胞膜结构的能力与其抑制脂肪细胞分化的能力密切相关，进而影响胞内脂肪合成相关信号通路。而脂质筏作为细胞膜上的一种动态的，高度有序的微区域，调节着细胞信号转导的过程，因此我们推测细胞膜脂质筏可能是柿单宁及其特征结构单元发挥强降脂生物活性的潜在分子靶标。因此，本文联用了多种技术手段，包括体外脂质体、大质膜囊泡、原位脂质筏探针、共聚焦显微镜、受激发射损耗荧光显微镜、分子动力学模拟技术等，从与脂质筏相互作用的角度系统综合性的考察了PT特征结构单元抑制前脂肪细胞分化的分子机制及构效关系，这也能为PT的构效关系及机制阐述提供新证据、新理解。结果发现PT特征结构单元代表能以一种倒V型方式通过没食子酰基较深的插入脂质筏疏水双分子层中心，破坏脂质筏结构的有序域，进而抑制了胞内成脂转录因子的激活，抑制脂质的积累，发挥强烈的抑制前脂肪细胞分化效应。此外，我们还基于多酚产生的不同脂质筏干扰效应构建了一种具有降脂活性多酚的快速筛选策略，这种筛选策略具有通量高、成本低、免于试剂等优点，突破了如何从数量多，结构杂的多酚中快速获得具有降脂活性多酚的瓶颈。

https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c00444

http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2017.06.012

相关文献：

邹波. 柿单宁基于AMPK和miRNA调节非酒精性脂肪肝和前脂肪细胞分化的分子机制.[博士学位论文].华中农业大学，2014.

余洁. 柿单宁特征二聚体稳定性及其抑制3T3-L1细胞分化的活性形式探究.[硕士学位论文].华中农业大学，2016.

朱维. 柿单宁特征结构单元基于细胞膜脂质筏受体抑制前脂肪细胞3T3-L1分化的分子机制.[博士学位论文].华中农业大学，2018.

3、柿单宁独特的解蛇毒功效源于其共价修饰磷脂酶 A2特定残基和对α-螺旋结构有强烈的破坏作用

2011年11月25日，华中农业大学杨杰和李春美*（通讯作者）在Journal of molecular structure发表了题为Spectroscopic investigations on the binding of persimmon tannin to phospholipase A2 from Chinese cobra (Naja naja atra)的研究论文。

我们的研究表明，PT对蛇毒所致的肌肉毒性、出血毒性、神经毒性以及致死毒性都有显著的抑制作用，具有显著的解蛇毒功效。进一步研究发现PT对蛇毒不同组分结合能力和选择性明显不同，特别对PLA2具有高度亲和力，且为非可逆结合。通过荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱、圆二色谱和 SDS-PAGE 凝胶电泳结合半干分子转印和NBT分析等技术手段探讨了PT与PLA2 的相互作用机理。结果发现，PT除了通过结合强烈破坏PLA2 的α-螺旋结构外，PT极有可能通过共价修饰PLA2分子中的赖氨酸残基，引起酶结构改变，进而降低其催化活性和毒性，这也许是PT在复杂生物体内解蛇毒作用的机理之一。

https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2011.11.019

相关文献：

杨杰. 柿子单宁与牛血清白蛋白和磷脂酶 A2相互作用的研究.[硕士学位论文].华中农业大学，2011.

2013年8月2日，华中农业大学张颖和李春美（通讯作者）在Toxicon发表了题为Interaction of characteristic structural elements of persimmon tannin with Chinese cobra PLA2的研究论文。

为了更全面地理解PT抑制PLA2的机制以及PT的构效关系。本文考察了PT的7种不同特征结构单元与PLA2的相互作用，其中包括EGCG、Myricetin、ECG、A-type ECG dimer、A-type EGCG dimer、B-type EC dimer、A-type EC dimer。结果发现，A型连接的EGCG二聚体和A型连接的ECG二聚体对PLA2催化活性的抑制作用高于单体和B型二聚体。与其他PT特征结构单元相比，它们诱发了PLA2更大的构象变化。此外，分子对接研究显示，除了赖氨酸残基外，其他残基如Trp18、Try27、Gly29、His47和Tyr63也参与了二者的相互作用。因此，A型连接的EGCG和ECG二聚体结构单元可能是PT和PLA2之间相互作用进而发挥解蛇毒功效的结构要求。

https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2013.07.022

2016年11月3日，华中农业大学张颖和李春美（通讯作者）在Journal of food and drug analysis发表了题为The detoxifying effects of structural elements of persimmon tannin on Chinese cobra phospholipase A2 correlated with their structural disturbing effects well的研究论文。

本文通过动物实验进一步考察了PT特征结构单元对PLA2诱导的小鼠模型的致死性、肌毒性和溶血的影响。此外，采用了包括表面等离子体共振、动态光散射和傅里叶变换红外光谱、分子对接、LC-MS/MS等方法以揭示PT对蛇毒PLA2的解毒机制。研究结果显示，PT的特征结构单元（EGCG、ECG、A型连接的EGCG二聚体和A型连接的ECG二聚体）可以中和PLA2的致死性、肌毒性和溶血性。此外，这四种结构单元的解毒作用与它们对PLA2的结构干扰作用有很好的相关性。而且进一步结果表明A型连接的EGCG二聚体和A型连接的ECG二聚体是PT在体内发挥解毒功效的结构基础。柿单宁对中华眼镜蛇PLA2催化活性及毒性抑制作用机制为：第一，柿单宁可通过与PLA2结合改变PLA2的二级结构，扰乱PLA2发挥活性及毒性的空间结构；第二，柿单宁结合于PLA2的活性疏水腔区，阻挡了底物小分子与活性中心的接触，并且干扰了钙离子结合环，从而抑制了PLA2的酶活，由于PLA2的部分毒性如溶血活性、肌肉毒性、致死毒性等依赖于其酶活性中心的完整性，因此该部分毒性也受到了抑制；第三，柿单宁通过共价修饰PLA2的某些对催化活性和毒性都至关重要的氨基酸残基，如组氨酸、赖氨酸、色氨酸和酪氨酸，而起到解毒作用。

https://doi.org/10.1016/j.jfda.2016.08.005

相关文献：

张颖. 柿单宁特征结构单元与中华眼镜蛇磷脂酶 A2作用机制研究.[博士学位论文].华中农业大学，2016.

四、以柿单宁为基础研发的功能产品

作为一种具备多重健康效应的功能膳食因子，该课题组开发了高纯度柿单宁、柿单宁除臭剂、原花青素口服液、柿全果粉、柿子果酱、柿子脆片等产品。相关产品及专利如下：

1.李春美， 杜静， 葛珍珍， 徐泽， 朱维. 一种柿子全果低温喷雾干燥粉及其制备方法，ZL2014101900840.9

2. 李春美，吴思，李凯凯，邓祥宜，彭进明. 一种柿子山楂果酱及其制备方法，ZL201710213858.X

3. 李春美，彭进明，刘滔，王冬林，徐泽.一种柿子全果果糕及制造方法与品质检测，申请号：CN201410500301.0

4. 李春美, 王玥, 李凯凯, 杨明美, 邓祥宜. 一种柿果乳酸菌发酵果汁饮料制备方法, 申请号：CN2017010601.324390

5. 李春美，李凯凯，石鑫，张亚杰，王瑞丰，徐金帅，贾洋洋.一种柿子低聚原花青素的制备方法及其应用，申请号：CN202010019052.9

6. 李春美，杜静，李凯凯. “柿果全粉高效制备关键技术研究”，通过湖北省科技厅组织的成果鉴定，鉴定结果：国际先进；2017.1

李春美，女，博士，三级岗教授，博导。中国园艺学会柿分会常务理事，中国农学会农产品加工分会理事。华中农业大学食品科技学院教指委主任。一直致力于植物多酚化学及其健康效应研究；入选瑞典“国际科学基金（IFS）”、“武汉市青年科技晨光计划”、“ 湖北省杰出青年基金”、“教育部新世纪优秀人才”等人才支持计划；主持国家科学基金面上项目、国家重点研发计划子课题、公益性行业专项子课题、国家“十二五”科技支撑计划子课题、教育部重点项目、湖北省重大科技攻关计划等课题30多项；以第一作者或通讯作者身份本领域Top期刊《Crit. Rev. Food Sci. Nutr.》、《J. Agric. Food Chem.》、《Food Chem.》、《Food Hydrocolloids》、《J. Funct.Food》、《Eur. J. Nutrition》、《Food Res. Intern.》及其它权威期刊上发表论文163篇，其中SCI收录94篇。主编和副主编教材各1部，申请发明专利14项，授权6项。获得广东省科技进步一等奖2项（排名第3）、中华人民共和国农业部科技进步二等奖（排名第6）、中国产学研合作创新成果奖一等奖（排名第6）、中国轻工业联合会科学技术进步奖（排名第4）及神农中华农业科技奖（排名第6）。

李凯凯，男，博士，华中农业大学食品科技学院副教授。主要从事果蔬营养成分在加工和贮藏中的变化及健康效应研究。目前主持多项研究课题，已在Mol. Nutri. Food Res. 、J Agri.Food Chem. 、Food Funct. 、J Nutr. Biochem. 、LWT-Food Sci Technol 、J Funct. Foods、J Ethnopharmacol.、J Chromatogr. B 等食品主流期刊发表论文20余篇。

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